基因检测的那些事 (一)

      随着分子生物学技术进步，特别是二代测序技术的成熟，肿瘤治疗的个体化运用的越来越普遍，受益的病人和病种越来越多。因此正确选择基因检测成为制定治疗计划的重要前提之一。从圈子里的帖子里发现很多病友的基因检测有很多问题甚至走了弯路。这里从专业角度尽量通俗地介绍基因检测及在肿瘤治疗过程的运用。由于免疫治疗的相关领域近来进展很快，将被着重介绍。

      肿瘤的发生和转移本质上是环境，生活习惯和基因间相互影响造成细胞的控制生长，迁移和死亡的基因中的某个或某些发生突变导致失控引起的。因此，如果只从治疗角度讲，针对失控的基因进行治疗是个体化治疗的关键。由于每个病人的失控基因不尽相同，因此查出每个人的基因变异是制定治疗方案的前提。

首先谈谈与靶向治疗有关的基因检测方面的问题

一，为什么有些病人基因检测阴性却任然对靶向治疗敏感？

首先，基因检测的方法多种多样，而检测的结果也很复杂。如何正确选择基因检测的方法，理解基因检测的结果，需要从肿瘤基因改变的类型和，基因检测的方法和及基因检测所能检测的基因改变类型谈起。

基因改变的类型通俗讲有点/或短突变，长缺失或插入，基因拷贝数改变，染色体一部分或全部缺失或增加及染色体一部分相互移位。这些缺陷，根据变异的位置类型和受累基因功能的不同，有些导致该基因功能增加，有些降低，并最终造成肿瘤发生，发展和或转移。这些变异中只有导致功能增高并致病的，才成为靶向治疗的靶目标。应为绝大部分的靶向药是靶基因的抑制剂。

目前成熟的测突变的DNA测序技术是一代也叫Sanger测序和二代测序。前者每次只能测几百个碱基，而每个基因少着几千个碱基，多着几千上万个碱基(可转录)，因此一代测序因为综合成本和时间原因只能局限于测几个基因。后者也叫平行测序或高通量测序技术，目前可同时测每个人的全套DNA序列。然而，二代测序有某些缺陷:只能测点突变或短的插入或缺失。一旦涉及到长的变异，拷贝数改变或染色体改变，则准确性急剧降低，主要导致假阴性。由于人体中绝大部分的DNA序列基本是无功能的，而且，很多基因与肿瘤无关，因此通常只需覆盖全部的肿瘤相关基因足够了。比较明确的肿瘤相关基因有500-600个。因此只测这些基因即降低成本又不影响结果。有些地方只测常见的KRAS，BRAF，EGFR，ALK等少数几个或十几个基因，成本会降低十数倍，(这种方法的有另外的缺陷，将在免疫治疗相关检查部分讨论)。关键的是，测序的准确的性与测序深度极度相关。正常测序深度用组织标本要达到1000，而外周血要达到2000。因此，在选择检测单位时一定不要忘了除了寻问测序基因谱外，还不要忘了问测序深度。拿到结果时一定再问平均测序深度。如果平均测序深度与标准相差太大，结果要打问号，特别是阴性结果。

由于二代测序的缺陷，涉及到大的基因变异，拷贝数和染色体改变的突变，目前的测序技术就无能为力的。因此，临床上有很多病人没有查到突变，用靶向药任然有效，一是因为突变类型不同，二代测序查不出，二是测序误差导致的假阴性也有可能。还有就是基因的某些部位由于结构问题或测序深度不够也会测不出来。

此外，尤其重要的是还有一种情况是，DNA序列变了，但氨基酸序列没变。因为蛋白质是功能性分子，基因的功能是通过它的蛋白质产物实现的。以前认为这种突变不会产生问题。然而，近来发现这种突变会对转录产生影响，导致功能改变。由于目前的数据分析技术的局限，绝大多数的报告不会提及或忽略这类突变。因此携带这些变异的病人，虽然检查结果阴性，实际上还是可以用靶向治疗的，这需要医生调用原始报告，亲自看，并且需要对这类突变有足够的认知。

二 为什么突变会有丰度的高低？有些病人治疗任然会出现耐药和转移？

首先，在正常细胞的分裂的过程中，大概每10的12次方次分裂会导致一次致病突变。带有这个突变的细胞如果不能被免疫系统识别清除，随着不断分裂，产生的后代细胞都携带这个特突变。这群细胞就是一个克隆。如果这个突变致癌，肿瘤就发生了。同理，在肿瘤细胞群中，由于不断分裂，新的突变也会随着不断产生。随着每一个新突变的产生，就会有一个新克隆。不同的克隆由于突变不同和发生的时间早晚，细胞数目不同。检测时就表现为不同突变有不同的丰度，即带有这种突变的肿瘤细胞在全部检查的细胞中的百分率。由于不同的突变会导致不同的特性，如果突变导致耐药，会导致敏感肿瘤细胞被杀死后原先比例很小的耐药克隆逐渐长大，表现为复发。如果突变导致侵袭性增加，则导致转移。由于突变产生的多少快慢与细胞的分裂次数有关，特别是肿瘤细胞的分裂速度大大高于正常细胞，因此肿瘤负荷越大，细胞越多，单位时间内的分裂次数也越多，导致耐药和转移突变的产生的可能性也越大。这就是为什么肿瘤治疗一定要尽早尽快杀死肿瘤细胞。也就是为什么肿瘤治疗的原则是:尽早，足量，规律和程序治疗。这个原则不但是化疗，放疗和靶向治疗需要遵循，免疫治疗也一样。

前面通俗地讲过，带有某种突变的肿瘤细胞在全部检查的细胞中的百分率就是丰度。因此，基因检测报告中的丰度是指标本采样区域的丰度。其它部位，甚至同一组织块的取样位置以外的丰度有可能不一样，甚至有不同的突变。但是，外周血的结果是平均值。

三 外周血和组织标本检查的差异

外周血的检查是基于肿瘤细胞会因某种原因死亡，并释放DNA到外周血中。拿到外周血标本后，去除有型细胞，剩下的存在于血清中的DNA就可能含有肿瘤细胞的DNA(正常细胞也会在死亡后释放DNA到外周血中)。测这个DNA标本的结果是包含了肿瘤细胞和正常细胞的突变在内的。绝大多数的公司会去除现有的正常人群的突变库中的突变，剩下的就是肿瘤细胞的突变。由于目前缺乏华人的数据，因此，对于华人的结果会有些误差。由于外周血的结果的可靠性很大程度上取决于是否有足够的肿瘤细胞DNA释放到外周血，因此治疗前是采血的最佳时间。另外肿瘤负荷越大，越容易成功。而组织标本中，原发灶，淋巴结和转移灶的突变谱很可能不一样(原因参前)。这就是为什么有些病人可出现大部分病灶有效，个别不敏感，这时可以取这个病灶的标本再查。

目前正在摸索的三代和四代测序技术的目标就是覆盖所有类型的变异，近来发展很快，希望早日技术成熟。让人担心的是二代测序设备的生产商会否因为利益把新技术hold住，推迟运用。